一文了解WB-BCA法

一、BCA法的原理

BCA法又被稱為Smith法，是由Pierce公司的Paul K. Smith等人在1985年對Lowry法進行改進，提出用BCA代替Folin-酚試劑而建立的（Smith, P.K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 1985, 150: 76-85.）。該方法的原理是，在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與Cu²⁺絡合，同時將Cu²⁺還原為Cu⁺，BCA螯合Cu⁺形成紫色絡合物，測定562 nm 的 OD 值來計算蛋白質濃度。

二、BCA如何與蛋白質反應

那雙縮脲反應是如何進行的？又是如何將Cu²⁺還原為Cu⁺的？

雙縮脲反應原理:

首先，脲就是尿素，兩分子尿素在一定的條件下（180℃左右加熱），生成一個分子氨（NH3）縮合得到雙縮脲。正是因為該物質是由兩分子脲縮合而成的，故名雙縮脲。雙縮脲在堿性溶液中能與極稀的硫酸銅溶液形成紫色絡合物，這個呈色反應叫做雙縮脲反應。

雙縮脲試劑最初是指能夠提供堿性條件和銅離子、用以鑒定或檢測雙縮脲存在的試劑。由于蛋白質分子中含有很多與雙縮脲結構相似的肽鍵，因此也能與銅離子在堿性溶液中發生雙縮脲反應，且顏色深淺與蛋白質的含量的關系在一定范圍內符合比爾定律，而與蛋白質的氨基酸組成及分子量無關，故可用雙縮脲法測定蛋白質的含量。

那為什么雙縮脲反應要在堿性條件下？

蛋白質雙縮脲反應實質是肽鍵絡合Cu²⁺，肽鍵是酰胺鍵的一種，其pKa大約為-0.5，當pH=-0.5時，有50%酰胺質子化，當pH-pKa＞2時，幾乎所有酰胺都去質子化。在強堿（pH 11.25）條件，可以促使肽鍵中N上的H⁺部分電離，電子云密度增大，易于和Cu²⁺配位，形成紫色螯合物。

BCA是如何螯合Cu⁺的？

當Cu²⁺被蛋白還原成Cu⁺，Cu⁺與蛋白質肽鍵的絡合能力變弱，此時BCA競爭性、特異性地絡合Cu⁺，形成穩定的紫色絡合物。

三、BCA測定蛋白濃度流程

1. 所需試劑：

BCA試劑（常溫保存），Cu試劑（常溫保存），PBS（磷酸緩沖液）（常溫保存），BSA（牛血清白蛋白）標準品-5mg/mL（-20℃保存）

2. 檢測方法：

微孔酶標儀法

3. 實驗步驟：

（1）工作液配制：

根據標準品和樣品數量，按50體積BCA試劑加1體積Cu試劑（50:1）配制成BCA工作液，充分混勻（混合時可能會有渾濁，但混勻后就會消失）。BCA工作液室溫24小時內穩定（建議現配現用）。

（2）標準品稀釋：

取10μLBSA標準品用PBS稀釋至100μL，使終濃度為0.5mg/mL。將標準品按0，2，4，6，8，12，16，20μL加到96孔板的蛋白標準品孔中，各孔加PBS補足至20μL。

（3）樣品稀釋：

將樣品作適當稀釋（最好多做幾個梯度，如作2倍、4倍、8倍稀釋），加20μL到96孔板的樣品孔中。（由于移液器在取小量樣品時誤差偏大，標準線前面的點可能不很準確，所以盡可能的讓樣品點落在標準線1/2后）

（4）含量測定：

各孔加入200μL BCA工作液，蓋上96孔板板蓋，于37°C放置15-30min。用酶標儀測定A562nm。將各稀釋濃度標準品的A562nm處數據導入Excel，做散點圖，得出標準曲線公式，根據標準曲線公式計算出未知蛋白的濃度。

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