NGS測序為什么需要文庫構建?

NGS即Next-generation sequencing，又叫第二代測序技術或者高通量測序技術或者下一代測序技術。

文庫是DNA/RNA樣本在測序前做的一系列準備，因為原始的核酸樣本無法直接用于測序，只有經過處理的樣本才能滿足測序平臺的要求，比如在DNA樣本兩端添加測序bi備的接頭；樣本量不足時，可以通過PCR擴增達到上機的要求等。NGS測序為什么需要文庫構建?讓我們一起來看看吧！

一、DNA文庫構建的內容

（1）片段化及末端修復

（2）加接頭

（3）PCR

注意：此處忽略磁珠純化的步驟。

RNA樣本的文庫構建更加復雜，需將RNA逆轉錄為cDNA才能進行上述的建庫流程，原理相同。

二、gDNA樣本在NGS建庫前要進行片段化的原因

Illumina測序儀可讀取的片段長度范圍在50-600bp（圖1）, 不同測序芯片和測序試劑，對應測序長度不同。而大部分完整人類gDNA長度≥10kb。所以對于大片段的DNA/RNA樣本，打斷是文庫構建的前提。(這個理由同樣適用于MGI平臺)

圖1.Illumina測序平臺針對不同應用推薦的測序讀長

三、DNA片段化后要加接頭(adapter/index)的原因和意義

一個完整的接頭包含三部分:通用引物(P5&P7) + index(i7/i5) + 測序引物(SP1&SP2)（圖2）

1. 通用引物用于簇生成，測序引物用于插入片段的測序；
2. 測序平臺決定接頭序列;
3. index用于區分同一批測序數據的不同樣本。當同一張芯片測序樣本數≥2時，由index來區分樣本。如果一張flow cell只上一個樣本，index可以不需要，但是通用引物(P5&P7)和測序引物(SP1&SP2)是必需的。

備注：樣本加上完整接頭的方式有至少有3種，但是最終文庫的接頭序列是一致，找時間專門寫一個接頭不同結構與連接方式的文章。

圖2 不同接頭結構的文庫

四、PCR和PCR-free兩種文庫的常見性問題

PCR是實現樣本量的手段之一。當投入的起始量較低，構建的文庫量較少，需要通過 PCR復制模板量，最終達到上機需求的量。反之，當樣本起始量足夠多的情況下，只需完成接頭連接，純化后即可上機測序。

但是PCR文庫比較常見。
1. 大部分樣本的起始量并不能直接滿足上機需求
2. 不經過PCR擴增的文庫，由于接頭呈現Y型，其物理結構特殊，容易導致文庫質控結果出現偏差

3. 接頭與模板比例高，純化不干凈，導致文庫的接頭殘留嚴重，降低整個文庫質量

五、不同試劑盒對樣本起始量要求不同

不同試劑盒會有不同的樣本起始量要求。試劑盒能滿足的樣本起始量主要是由它自身酶的靈敏度、特異性以及穩定性決定的。樣本起始量越低 (如新冠鼻咽拭子樣本)，對酶的要求越高，相對的價格也越高。而且針對低起始量樣本建庫的試劑盒都有各自的技術zhuan利和優勢，所以也是價格高的另一個原因。

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